分类： 技术方法

  • scATAC-Seq，一种加速单细胞测序的技术发布190624

    scATAC-Seq，全称single-cell Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，由哈佛大学HSCRB研究者和Bio-Rad Laboratories联合在2019年6月24日Nature Biotechnology发布。

    scATAC-Seq是在2013年斯坦福大学William J. Greenleaf、Jason Buenrostro和Howard Y. Chang实验室开发的用于研究染色质可及性的ATAC-Seq技术基础上开发的测序技术，ATAC-Seq原理是通过转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性，然后对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。

    ATAC-seq可识别DNA的哪些部分被解开，从而能有蛋白接近进行调控，其每次反应可以分析100个细胞，而新方法可以将这个数字扩大到了50000个。

    对于单细胞测序中分离细胞这一挑战，scATAC-Seq使用ddSEQ和Bio-Rad的Droplet Digital技术解决，简而言之就是在仪器的一个通道中放置一个细胞，另一个通道添加一种微珠，每个珠子都有一个条形码标签。它们相遇的地方有油，因此会形成液滴。每个液滴都包含一个细胞和一个微珠。这样可以添加很多细胞，获取单独标记细胞的数据。其细胞捕获效率达到95％。

    参考阅读
    https://news.harvard.edu/gazette/story/2019/06/new-atac-seq-method-from-harvard-accelerates-single-cell-research
    https://www.selectscience.net/product-news/bio-rad-launches-its-scatac-seq-solution?artID=49297/
    https://www.nature.com/articles/s41587-019-0147-6
    http://www.ebiotrade.com/newsf/2019-6/2019624164154659.htm

  • DNA microscopy，3年后更新专利新数据190620

    DNA microscopy是Broad研究所张锋等发明的一种观察细胞的新技术。

    技术原理
    先将细胞培养中选定的RNA反转录为cDNA，然后利用独特的核苷酸链（UMI）标记待研究的分子。这些标记会自我扩增，当它们扩增到与另一个cDNA标记接触时，连接处就会产生一个独特的核苷酸标签（UEI）。如果两个cDNA分子一开始十分接近，那么它们的扩增拷贝就会频繁地结合在一起，产生的标签就会比两个相距更远的cDNA分子更多。然后提取并分析细胞中DNA。借助算法推断出DNA分子的原始位置，从而生成图像。

    技术价值
    借助DNA microscopy，我们可以绘制出与合成DNA标签相互作用的分子群——细胞基因组、RNA和蛋白质。
    这是一种全新的生物学可视化方式。从某种意义上说，最初的cDNA分子就像无线电发射塔一样，以DNA分子的形式相互发送信息。研究人员可以检测到一座“信号塔”与附近的另一座“信号塔”的通讯，并使用“信号塔”之间的传输模式来映射它们的位置。
    传统的光学显微镜无法区分具有不同DNA的细胞，如具有特定基因突变的肿瘤细胞或免疫细胞。DNA microscopy可以通过识别能够攻击肿瘤的免疫细胞来帮助改善某些癌症的治疗。此外，随着神经系统的发育，细胞通常会产生独特的RNA来合成特殊的蛋白质，这项技术也可以帮助研究人员研究这类细胞。
    DNA microscopy直接从被研究的分子中捕获信息，开辟了一种将基因型与表型联系起来的新方法。

    技术不足
    该技术还不能揭示细胞内部的细节。

    商业研发
    空间基因组学相关技术在肿瘤学、神经科学和免疫学等疾病领域中将有很广泛的应用前景，而且有可能用于更广范围的生物学研究。目前，许多公司正在开发该领域的产品，包括10x Genomics、NanoString Technologies、Bruker、BioSpyder及Cartana等。

    发展历史
    2016年，张锋和Joshua Weinstein作为发明人申请DNA microscopy的专利（PCT/US2016/051164）。
    2019年6月19日，bioRxiv发布了“DNA microscopy: Optics-free spatio-genetic imaging by a stand-alone chemical reaction”的预览版，6月20日，Cell发布了全文。

    参考阅读
    https://www.biorxiv.org/content/10.1101/471219v1
    http://www.ebiotrade.com/newsf/2019-6/2019620153439603.htm
    https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30547-1
    测序中国微信公众号6月21日推文
    https://www.broadinstitute.org/patents/dna-microscopy
    https://www.broadinstitute.org/files/patents/WO2017044893_0.pdf

  • CAST，一种高效的基因敲入技术190605

    技术背景：CRISPR敲入效率低
    当前，CRISPR技术主要用于基因敲除，在特定的场合下，一些外源基因或DNA片段也需要插入到不同生物体的基因组中特定的位置，虽然CRISPR也能实现基因组定点插入或整合，但是敲入效率远远低于基因敲除的效率。主要是利用Cas9酶类蛋白切开基因组上的DNA链，然后利用宿主的DNA修复系统来实现外源DNA片段的整合。但是，这严重依赖宿主的效率有限的DNA修复系统，从而导致基因敲入整体效率不高。

    技术优化
    MIT张锋团队在NIH的Eugene Koonin教授所在团队的研究基础上，与其合作开发了一种全新的基因敲入技术，在原核生物大肠杆菌中实现了基因整合效率高达80%，称之为CRISPR相关的转座酶系统(CAST)，该进展被发表在Science在线杂志上。https://science.sciencemag.org/content/early/2019/06/05/science.aax9181?rss=1

    技术原理
    研发团队借助转座子插入外源DNA达到优化CRISPR敲入效率的问题。他们将Cas9切刻酶（D10A）偶联到单链DNA转座酶TnpA上，然后在大肠杆菌基因组中检测到了这种蛋白复合物能够促进外源DNA的定点整合，这说明利用转座子可以实现基因敲入，虽然单链DNA模板的制备和体内递送还存在问题。
    研究者利用两种蓝藻中的相关基因分别构建了ShCAST和AcCAST两种CAST系统，每个系统均包含3个质粒，其中pHelper质粒包含转座相关的4个CAST基因(tnsB, tnsC, tniQ和Cas12k)。分别测试了不同CAST基因和不同长度的tracrRNA对CAST系统的活性的影响。结果发现4种CAST基因对于外源基因整合是必需的，同时216 bp的tracrRNA足以产生外源基因的整合，并且他们还证实这种基因整合只发生一次，从而避免了多次基因插入。同时，他们还分析了不同长度的DNA插入片段的整合效率，结果500 bp到10 kb均能有效的插入到特定的位点。另外，研究者还优化了与基因整合相关的LE和RE序列，将它们分别缩短到113 bp和155 bp。
    为了进一步证实CAST系统的功能，研究者在体外重构了ShCAST系统，分析了shCAST系统的特异性。通过测序，研究者发现外源DNA的整合集中于靶点位置，而那些主要的脱靶位点在整体比例中占比不到1%。这说明shCAST系统对于基因敲入的特异性相当高。因此，考虑到高达80%的基因敲入效率，和低于1%的脱靶效应，ShCAST系统堪称极为优异的基因敲入技术平台。

    研发团队
    NIH的Eugene Koonin教授对生物体内天然存在的转座子相关的CRISPR-Cas系统进行了深入的研究，并且发现了二者之间存在着密切的联系，尤其是发现了一些类似Tn7转座子相关的迷你型的CRISPR-Cas系统可以促进转座子在基因组上的扩散。MIT张锋团队和Eugene Koonin团队展开了合作，在这类复合型天然系统的基础上，他们开发出了CRISPR相关的转座酶系统(CAST)，并且成功的运用于基因敲入。

    技术价值
    CAST基因敲入系统不是简单的修修补补，而是从头开始设计，并从大自然进化的生物中寻求完整的解决方案，从而突破了原有系统的瓶颈，实现了基因敲入效率的跨越式提升。该系统还有一些瑕疵，比如会将转座子相关元件（LE和RE序列）也整合到基因组中，但这可以通过插入到内含子中消除这些元件的影响。更重要的是，如果这套系统也适用于哺乳动物细胞基因组编辑，将为生物基础理论研究提供巨大的支持，同时也进一步增加了临床治疗遗传性疾病和癌症的希望。

    参考阅读
    金斯瑞生物微信公众号（GenScriptBiotech）2019年6月10日推送文章